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考馬斯亮藍染色測定蛋白質(zhì)含量

更新時間:2016-07-18 點擊次數(shù):3665

考馬斯亮藍染色測定蛋白質(zhì)含量

 

一、實驗原理

考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue)測定蛋白含量存在著兩種不同顏色形式,紅色和藍色。此染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色由紅色形式轉(zhuǎn)變藍色形式,zui大光吸收由465nm變成595nm。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi),蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律(Beer’s law),因此可以通過測定染料在595nm處吸收的增加量得到與其結(jié)合的蛋白質(zhì)量。本法測定范圍為10~100µg蛋白質(zhì)。

由于該法簡單、迅速、干擾物質(zhì)少、重復(fù)性好、靈敏度高,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)含量測定。

 

二、實驗用品

(一)器材

    (1) 722分光光度計。

    (2) 微量進樣器。

    (3) 移液管(0.1ml及5ml)。

    (4) 試管及試管架。  

 

(二 )、試劑

     (1)標準蛋白質(zhì)溶液:結(jié)晶牛血清白蛋白,預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法或按牛血清白蛋白OD1%1cm=6.6測定蛋白質(zhì)含量,再用0.15mol/L NaCl配制成1mg/ml蛋白質(zhì)溶液。

     (2)考馬斯亮藍試劑:考馬斯亮藍G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中,加入100ml 85%磷酸,用蒸餾水稀釋至1000ml,濾紙過濾。zui終試劑中含0.01%(W/V)考馬斯亮藍G-250,4.7%(W/V)乙醇,8.5%(W/V)磷酸。

    (三)材料

         末知蛋白質(zhì)溶液,要求蛋白質(zhì)濃度范圍為0.1~5mg/ml,若濃度過度時,需用0.15mol/LNaCl溶液適當稀釋。 

 

 

三、實驗程序

  (一)操作方法

   1.標準法制作標準曲線

    取14支試管,分兩組按表1-1平行操作。

OD595縱坐標,標準蛋白為橫坐標,在坐標紙上繪制標準曲線。

 

 2.微量法制作標準曲線

    取12支試管,分兩組按表1-2平行操作。

3.末知樣品蛋白質(zhì)濃度的測定 

  測定方法同上,取合適的末知樣品體積,使其測定值在標準曲線的直線范圍內(nèi),根據(jù)所測定的OD595值,在標準曲線上查出其相當于標準蛋白的量,從而計算出末知樣品的蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)。

 

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